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产品描述

第一链cDNA合成预混液是以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本产品含有反转录反应所需的全部试剂（Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Oligo(dT)18, Random N6, dNTPs）。反应时只需要加入RNA模板和引物，操作简单，降低操作过程中的污染。本制品含有去基因组成分gDNA Purge，以RNA为模板进行cDNA第一链合成时，只需一步操作，可以同步去除基因组DNA污染，反应结束后，85℃加热5分钟，即可从无活性的酶切产物中回收cDNA。合成的第一链cDNA能直接用于PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或变性RNA扩增，也可用于需要带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。
另外，本产品提供了Plus No RT Control，用于检测逆转录酶对照反应，检验RNA模板中是否存在基因组DNA残留。

产品特点：

- 本制品采用耐高温逆转录酶，大幅度提高了热稳定性和cDNA合成效率。
- 本制品中添加的NovoScript Reverse Transcriptase RNase H活性，可避免第一链cDNA合成过程中，RNA/DNA杂交模板链中RNA被降解，保证cDNA合成的质量。
- 本制品中添加的No RT Control，可减少引物延伸过程对cDNA合成的干扰。

产品组成：

| 产品组成 | 50次 (20μl体系) | 100次 (20μl体系) |
| --- | --- | --- |
| 2×Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 500μl | 1ml |
| gDNA Purge | 50μl | 100μl |
| 2×Plus No RT Control | 50μl | 100μl |
| RNase Free Water | 1ml | 1ml×2 |

使用方法：

1、cDNA第一链合成：
试剂配制后，各组分均匀混合后置于冰上。

（1）反应体系配制：

| 组分 | 体积 |
| --- | --- |
| 2×Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 10μl |
| 模板 RNA | 总RNA(0.1 ng - 1μg) |
| | mRNA(≥10 pg) |
| | 特异性 RNA(≥0.01 pg) |
| gDNA Purge | 1μl |
| RNase Free Water | 至 20μl |

移液器轻混匀后短暂离心至管底。

（2）No RT Control反应（可选）
用于配制无逆转录酶对照反应，检验RNA模板中是否存在基因组DNA残留。

| 组分 | 体积 |
| --- | --- |
| 2×Plus No RT Control | 10μl |
| 模板 RNA | 总RNA(0.1 ng - 1μg) |
| | mRNA(≥10 pg) |
| | 特异性 RNA(≥0.01 pg) |
| gDNA Purge | 1μl |
| RNase Free Water | 至 20μl |

移液器轻混匀后短暂离心至管底。

（3）反应程序：

| 温度 | 时间 |
| --- | --- |
| 50°C | 15min |
| 85°C | 5s |

2、第一链cDNA的qPCR扩增
合成的第一链cDNA可直接用于qPCR。

常用反应体系（20μl）：
（此处表格内容可能缺失，但通常包括cDNA模板、引物、qPCR预混液和水）

三步骤扩增程序：

| 温度 | 时间 | 循环数 |
| --- | --- | --- |
| 95°C | 1min | 1 |
| 95°C | 20s | 40 |
| 50-60°C | 30s | 40 |
| 72°C | 30s | 40 |

注意事项：

1. 用DEPC处理实验用的所有实验器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2. 确保所用试剂中无RNA酶污染。
3. 试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保盖好。
4. 纯化过的RNA必须保证不含盐，金属离子，乙醇和氯仿，以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除微量污染物。
5. 为保证反转录反应的有效性，需使用高质量的RNA模板。
6. 当模板含量较低或后续PCR扩增片段过长时可以适当延长逆转录时间。
7. 2×Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、gDNA Purge及2×Plus No RT Control含有甘油，使用前请充分混匀后再开瓶离心收集至管底再进行使用。

储存/保存方法

-20°C保存

温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究